Larry Daley (Ben Stiller) se ve obligado a decir adiós a todos sus amigos cuando deciden hacer el Museo de Ciencias Naturales más "interactivo" y sustituyen todas las figuras por hologramas. Sus amigos históricos son empaquetados y enviados a los archivos del Smithsonian en Washington, D.C., el museo más grande del mundo. No han pasado ni 24 horas cuando Larry recibe una llamada de Jedediah, el cowboy en miniatura, y descubre que la tabla de Ahkmenrah ha sido extraviada y esto ha hecho que el Smithsonian cobre vida. Para salvar a sus amigos, Larry tendrá que viajar a Washington, D.C. y luchar contra Kahmunrah, Al Capone, Iván el Terrible y Napoleón, que han planeado un complot para apoderarse del museo, y después del mundo.
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